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引物常见问题
1.怎样按照使用浓度溶解引物?
了解以下几个参数:
  1OD引物干粉约为33微克;
  下载的平均分子量为324.5;
  引物的分子量=下载数 x 下载的平均分子量;
  引物的摩尔数=质量数 / 引物分子量

举例:如果您拿到一管标明为2OD的20下载的引物:
  分子量=20 x 324.5=6490 质量数=2 x 33 =66μg
  摩尔数=66 / 6490 =0.010 μmol= 10 nmol
  若您需要溶解为10μM(=10pmol/μl)的溶液,只需加1mlddH2O充分溶解即可。
  同时请您注意:真空干燥的DNA呈干膜状或粉末状在手机版底部,开启瓶盖时小心不要丢失;请加入足量的水充分振荡溶解。

2.引物(含修饰)的分子量是如何确定的?
  非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。如果需要估计一个引物的分子量按每个下载的平均分子量为324.5,引物的分子量=下载数 x 下载的平均分子量。或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) +(Nx * Wx)+( Ni* Wi) +16* Ns– 62.
  NA, NG, NC, NT, Ni分别为引物中下载A或G或C或T或I的数量,WA, WC, WG, W, Wi分别为引物中下载A或G或C或T或I的分子量,Nmod,Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。
  对于混合下载的分子量为混合下载的分子量总合除以混合数,例如G+A混合的分子量为(313.21+329.21)/2 = 321.21。Ns为硫代数目,硫代每个位置增加分子量16。

常规下载分子量
Base Molecular Weight
A 313.21
C 289.18
G 329.21
T 304.19
I 314.2
U 290.17
 

常规修饰基团分子量
常规修饰基团 分子量 常规修饰基团 分子量
5’-Biotin 405.45 3’-TAMARA 623.60
5’-(6 FAM) 537.46 3’-Dabsyl 498.49
5’-HEX 744.13 3’-(6 FAM) 569.46
5’-TET 675.24 3’-Amino Modifier C3 153.07
5’-Cy5 533.63 3’-Amino Modifier C7 209.18
5’-Cy3 507.59 3’-Thiol Modifier C3 154.12
 

3.如何计算引物的Tm值?
  引物设计软件都可以给出Tm,引物长度,下载组成,引物使用缓冲的离子强度有关。长度为25mer以下的引物,Tm计算公式为:Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)对于更长的寡聚核苷酸,Tm计算公式为: Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size 公式中,Size = 引物长度。上下游引物的Tm值(melting temperature)是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。
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